學(xué)習(xí)一下反向色譜柱的活化步驟和優(yōu)化條件

反向色譜柱綜合了硅膠和聚苯乙烯色譜柱的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)避免了它們的缺點(diǎn)。以乙烯醇共聚物為基質(zhì)的色譜柱，即使含有高載炭量也能保持表面濕潤。多孔結(jié)構(gòu)具有足夠大的平均孔徑，可獲得理想的小分子化合物、多肽和小分子蛋白分離效果。在有機(jī)溶劑含量較高的流動(dòng)相中，該柱的柱效與硅膠基質(zhì)色譜柱相當(dāng)，但在以堿性緩沖溶液為流動(dòng)相時(shí)，分離效率超過硅膠柱。其顯著特點(diǎn)之一是基質(zhì)被烷基化填料的洗脫順序，其保留能力與烷基鏈長度成正比。

反相色譜柱的活化步驟：

1、使用20倍柱體積的甲醇或乙腈來洗滌色譜柱是必要的。

2、如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)該使用與流動(dòng)相中鹽的數(shù)量相等的超純水和有機(jī)相來沖洗過渡。沖洗時(shí)的用量應(yīng)為20倍色譜柱體積，然后使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相來平衡色譜柱，用量應(yīng)為20倍色譜柱體積或更多。

3、在流動(dòng)相中不含緩沖鹽時(shí)，應(yīng)該使用容量為柱體積的20倍或更多的流動(dòng)相平衡色譜柱。

4、在壓力基準(zhǔn)穩(wěn)定的情況下，如果不穩(wěn)定，就可以延長平衡時(shí)間。

改善反相色譜柱的操作參數(shù)：

一旦確定了色譜柱規(guī)格、適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘀盍?、流?dòng)相溶劑和添加劑，即可開始進(jìn)行方法優(yōu)化。方法的優(yōu)化取決于具體目標(biāo)。若需開發(fā)質(zhì)量控制方法，可能需要采用較少可變因素的等度分離方法。若目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)較高的分離度，而節(jié)省分析時(shí)間并非首要考慮，則可選擇較長的柱子實(shí)現(xiàn)更好的組分分離。若分離速度至關(guān)重要，則應(yīng)選擇較短的柱子和更高的流速。對(duì)于含有多種目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，使用等度分離可能不足以解決問題，應(yīng)考慮開發(fā)和優(yōu)化梯度方法。

根據(jù)慣例，被稱為“流動(dòng)相A”的是水相溶劑和在反相色譜中相對(duì)較弱的溶劑，“流動(dòng)相B”則是具有更高和更強(qiáng)溶劑成分的。在反相色譜模式下，增加B的百分比通常會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間縮短。值得注意的是，在實(shí)際分析方法開發(fā)之前，許多人采用“試錯(cuò)”方法來發(fā)展HPLC方法，不斷嘗試不同流動(dòng)相條件，以找到較佳條件。